Neoantijen keşfini açıklanabilir, izlenebilir ve sınanabilir hâle getiren İstanbul merkezli araştırma platformu.

Rol sözleşmesi, serbest ajan değil

Her ajan bildirimli olarak kaydedilir: hangi veri nesnesini okuyabilir, hangi alanı yazabilir, hangi eşikte durur. Ajan rolü çalışma zamanında zorlanır; kendi görev tanımını genişletemez.

Bütçeli bağlam ve provenans

Ajanlar yalnızca kendi kapsamına ayrılmış, sürümlenmiş veri kümesini görür. Kimliği, birimi, ölçüm sınırı, kaynağı ve yöntem sürümü olmayan hiçbir kayıt değerlendirme setine sessizce giremez.

Küçük veride düşük karmaşıklık

32 hastalık ölçekte derin modeller yerine şeffaf özellik ağırlıklı puanlama, düzenlileştirilmiş lojistik model ve kural tabanlı raporlama tercih edilir. Belirsizlik gizlenmez, raporlanır.

Tümör–normal WES, tümör RNA-seq ve HLA verilerinden türetilen kalite kontrollü özelliklerin, peptit–HLA tahminlerinin ve deneysel kapasite kısıtlarının birlikte kullanıldığı bir önceliklendirme yaklaşımı; aynı sayıda ve aynı nitelikte deney slotu kullanıldığında, önceden belirlenmiş referans sıralama yöntemlerine kıyasla daha fazla geçerli mutant-seçici T-hücresi yanıtının saptanmasını sağlayabilir mi?

Belirlenmiş geçerli deney kapasitesi K altında, hasta bazında saptanan geçerli mutant-seçici donör T-hücresi yanıtı verimi (yield@K) ve kilitli referans sıralama yöntemi ile karşılaştırılması.

Birleşim havuzu ve rastgele slot tahsisi

Yalnızca AI'nın önerdiği adayların test edilmesi ve referans yöntemin ölçülmemiş adaylarının başarısız kabul edilmesi yasaktır. Hasta bazında ortak deney kotası içinde AI ve referans top-K adaylarının birleşim kümesi, gerektiğinde ortak havuzdan rastgele ayrılan slotlar veya eşleşmiş dengeli deney planı kullanılır.

Hasta düzeyinde ayrım

Model eğitiminde peptitleri rastgele ayırıp aynı hastanın peptitlerini eğitim ve teste dağıtmak yasaktır. Aynı hastadan gelen farklı peptitler, HLA alternatifleri, farklı donörler ve teknik tekrarlar bağımsız hasta gözlemi sayılmaz; gerektiğinde lokus ve donör düzeyinde ek sızıntı kontrolleri uygulanır.

Hasta bağımsızlık birimi

Güven aralıkları hasta düzeyinde bootstrap veya eşleştirilmiş hasta analiziyle hesaplanır. precision@K, recall@K (yalnızca değerlendirilen aday evreninde) ve uygun durumda NDCG destekleyici metriklerdir. Çoklu keşifsel sonlanımlar düzeltilmemiş üstünlük kanıtı olarak sunulmaz; etki büyüklüğü ve belirsizlik önceliklidir.

Eşleşmiş tümör–normal tüm ekzom

• Hedef ortalama kullanılabilir kapsama: tümör ≥100×, normal ≥50×
• Twist Human Comprehensive Exome veya doğrulanmış eşdeğer panel; NovaSeq 2×150 bp
• '30 M read pair = 100×' gibi otomatik eşdeğerlik varsayılmaz; gerçek hedef alan ve duplikasyon hesaba katılır
• FastQC/MultiQC → GRCh38 hizalama → Mutect2 benzeri somatik çağırım + panel-of-normals → FILTER/INFO gerekçeli VCF → VEP
• Tümör–normal kimlik eşleşmesi kalıtsal SNP uyum analiziyle; ayrı STR hizmeti rutin olarak bütçelenmez

Hasta bazlı tümör ekspresyon profillemesi

• Illumina Stranded mRNA-Seq, ~40 M paired-end read pair/örnek (2×150 bp)
• Birincil amaç diferansiyel ekspresyon testi değil, hasta bazında gen/transkript profillemesidir
• RIN düşük örneklerde rRNA-deplesyonlu Stranded Total RNA-Seq ve artırılmış derinlik değerlendirilir
• Mutasyonun RNA okumasıyla doğrudan desteklenmesi yardımcı kanıt olarak raporlanır; genel gen ekspresyonu mutant allelin ifadesini kanıtlamaz
• Tümör saflığı ve normal doku karışımı nedeniyle negatif RNA desteğinin anlamı sınırlıdır

Hasta HLA'sı normal DNA alikotundan; donör HLA'sı ilgili periferik kandan. Yüksek çözünürlüklü HLA-A, -B, -C iki alan/alan eşdeğeri tipler ana HLA-I kapsamını oluşturur. HLA-II ana sentez stratejisinde zorunlu değildir. Donör–hasta eşleştirmesinde adayı sunabilecek doğrulanmış aynı alel temeldir; alel eşleşmesi yoksa reaktivite uygun kontrol olmadan yorumlanmaz.

Sınıf I havuzu ağırlıklı olarak 9, 10 ve 11 aminoasitlik peptitlerden oluşur. Her mutant peptit için aynı pozisyon ve uzunlukta WT kontrol peptidi eşleştirilir. RUO çerçevesinde, ≥%95 HPLC saflığı ve kütle spektrometrisi ile kimlik doğrulaması temel kalite hedefidir; lot, kuru miktar, kromatogram, çözündürme ve saklama koşulu LIMS'e kaydedilir.

Germline veriler ve somatik varyantlar aynı hasta için ayrı güvenlik alanlarında tutulur. Klinik anlam taşıyan olası kalıtsal tesadüfi bulgular proje araştırma çıktısı olarak otomatik raporlanmaz; klinik yönetime aktarım ancak ayrı etik/kurumsal prosedür ve doğrulama ile ele alınır.

Kontrollü peptit uyarımı / priming

LRS sistemi tasarımdan çıkarılmıştır; donör T-hücresi ve monosit kaynağı, gerekli onam ve izinlerle sağlıklı gönüllü periferik kanıdır. İlk 4–6 HLA tanımlı donörde PBMC verimi, canlılık, naif CD8+ yüzdesi, monosit geri kazanımı, çözdürme sonrası canlılık, kültür kurulabilirliği ve sarf tüketimi ölçülür. MACS/FACS yalnızca ayrım yöntemidir, LRS yerine bir hücre kaynağı değildir.

Koşullu, önceden tanımlı alt küme

Otolog kol, yeterli canlı PBMC elde edilen ve onamı uygun hastalarda yürütülür. Tedavi öyküsü, lenfopeni durumu, başlangıç hücre sayısı ve çözme sonrası canlılık yorumun ön koşuludur. PD-1⁺ CD8 zenginleştirmesi, hücre geri kazanımının pilotta gösterilmesine bağlı koşullu bir alt analizdir ve tüm tümöre özgü hücreleri kapsadığı varsayılmaz. Otolog testte sonuç alınamayan hastalar donör pozitifleriyle ikame edilerek 'otolog pozitif' raporlanamaz.

Karşılaştırma birimi aynı hastaya ait aynı mutant peptit–HLA adayıdır. Hücre kaynağı ve kültür protokolleri farklı olduğundan mutlak ELISpot sayıları doğrudan eşdeğer sayılmaz.

Teknik geçerlilik + arka plan kontrolü + mutant–WT farkı birlikte sağlanır.

Kontroller geçerli, yanıt saptanmadı. İmmünojenisite yokluğu kanıtı değildir.

Pozitif kontrol başarısız, canlılık düşük veya kuyucuk artefaktı. Negatifle karıştırılmaz.

Sinyal eşik civarında veya tekrarlar uyumsuz. Belirsizlik korunarak raporlanır.

Kapasite, materyal veya HLA eşleşmesi yok. Eksik gözlem negatif sayılmaz.

HLA sunum potansiyeli

Yayınlanmış MHC-I sunum/bağlanma tahmin skorlarının standardizasyonu ve sıralamaya girdi olarak kullanımı. İmmünopeptidomik veri olmadan yerel 'doğal sunum doğrulandı' etiketi üretilmez.

Donör yanıtı saptanabilirliği

HLA bağlamı, moleküler özellikler ve donör materyal kapasitesiyle geçerli mutant-seçici yanıt olasılığının sıralanması. Şeffaf ağırlıklı puanlama ve düzenlileştirilmiş lojistik model esas alınır.

Otolog yanıt keşfi

Yeterli otolog etiket bulunursa keşifsel değerlendirme. M2'nin pozitif donör etiketi M3 için otomatik pozitif etiket yapılamaz.

Çapraz reaksiyon ve sınır kanıtı

Mutant–WT ayrımı, seçilmiş normal peptit kontrolleri ve ek hedef panellerinin kural tabanlı raporlanması. Birkaç deneyle evrensel çapraz reaksiyon yokluğu ilan edilemez.

Aday kanıt dosyası

M1–M4 çıktıları, donör ve otolog sonuçlar, TCR kanıtı, doğal hedef durumu, test edilmemiş alanlar ve belirsizlikler ayrı katmanlarda; veri provenansı ve sınırlı araştırma kullanım uyarısıyla.

Masaüstü laboratuvar uygulaması ClickOnce ile dağıtılan bir .NET istemcisidir: WCF wsHttpBinding üzerinden sertifika tabanlı mesaj kimlik doğrulaması (TransportWithMessageCredential), MySQL veri erişimi, iTextSharp ile PDF üretimi, Excel/VBE interop ile rapor aktarımı ve dört yerelleştirme kaynağı (en-US, ru-RU, az-Latn-AZ, tk-TM) içerir. Kurumsal imza sertifikasıyla yayımlanmıştır.

Pakette gömülü sertifika ve bağlantı materyali bulunduğundan, dağıtım dosyaları gizli materyal olarak ele alınmalı ve sürüm kontrolüne açık biçimde konulmamalıdır.

• Masaüstü istemci → tarayıcı tabanlı araştırmacı paneli; ClickOnce dağıtımı yerine sürümlü web dağıtımı
• WCF SOAP uç noktası → belgelenmiş REST/GraphQL API; sertifika + 2FA + RBAC birlikte
• Doğrudan MySQL erişimi → yetkilendirilmiş servis katmanı, satır düzeyi erişim ve denetim izi
• Office interop raporları → sunucu tarafı PDF/CSV üretimi, şablon sürümleme
• Dört dilli kaynak dosyası → merkezi i18n sözlüğü; arayüz TR/EN, veri alanları dil bağımsız
• Serbest metin alanları → kontrollü sözlük, birim ve ölçüm sınırı zorunluluğu

Klinik kayıt ve onam

Uygunluk, onam sürümü, klinik veri sözlüğü, dışlama gerekçeleri.

Numune ve soğuk zincir

Transfer formu, sıcaklık kaydı, ambalaj uygunluğu, kabul durumları.

Moleküler QC

Qubit, saflık, RIN, izolasyon verimi, teslim edilen miktar, tekrar gerekçeleri.

Biyoinformatik sürümleme

Referans genom, transkript sürümü, parametrik filtreler, algoritma paketi.

Peptit ve lot yönetimi

Mutant/WT eşleşmesi, HPLC/MS belgeleri, lot, stok, çözündürme.

Hücre bankası ve kriyotank

Donör–HLA–alikot bağı, canlılık, çevrim sayısı, alarm ve konum izleme.

Deney defteri

Plaka haritası, kontrol kabul ölçütleri, operatör, cihaz/lot, ham çıktı dosyası.

Model kayıt defteri

Model kartı, özellik listesi, kilit zaman damgası, performans ve hata türleri.

Klinik örnekleme, her merkezin onaylı araştırma protokolü, etik kurul kararı ve kurum izni uyarınca yürütülür. İlk hasta kaydı, biyolojik materyal alımı ve herhangi bir genomik çalışma; gerekli onam, kurum izni ve veri/numune paylaşım sözleşmeleri tamamlanmadan başlatılmaz.

Araştırma materyalinin klinik tanısal gereksinimlere tahsisi her durumda önceliklidir. Hiçbir doku yalnızca projeye ayrılmak amacıyla tanısal işlemi aksatmaz.

Genetik ve sağlık verileri özel nitelikli kişisel veri olarak yönetilir. Hasta kimlik anahtarı klinik merkezde tutulurken yazılım ekiplerine yalnızca kodlanmış, asgari gerekli veriler aktarılır. Numunenin gelecekteki kullanımı, biyobanka kapsamı, saklama süresi, olası ticari Ar-Ge işlemleri ve onamın geri çekilmesi ayrı hükümlerle tanımlanır.

Veri sorumlusu ve veri işleyen rolleri sözleşmeyle belirlenmeden kişisel/klinik veri paylaşımı yapılmaz.

Laboratuvar, yazılım ekibi, klinik merkezler ve dış hizmet sağlayıcıları aynı kalite sözlüğünü kullanır. Her ölçüm; analiz kaynağına, kullanılan sürüme, operatöre, cihaz/lot bilgisine ve ham çıktı dosyasına geriye dönük bağlanabilir. Kabul dışı sonuçlar rapordan silinmez; yeniden çalışma nedeni kaydedilir.

Bilimsel kararları etkileyen sürüm değişiklikleri onay ve değişiklik kontrolüne tabidir.

Collins, G. S., Moons, K. G. M., Dhiman, P., Riley, R. D., et al. (2024). TRIPOD+AI statement: Updated guidance for reporting clinical prediction models that use regression or machine learning methods. BMJ, 385, e078378. doi

Hundal, J., Kiwala, S., McMichael, J., Miller, C. A., et al. (2020). pVACtools: A computational toolkit to identify and visualize cancer neoantigens. Cancer Immunology Research, 8(3), 409–420. doi

Ott, P. A., Hu, Z., Keskin, D. B., Shukla, S. A., et al. (2017). An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. Nature, 547, 217–221. doi

Reynisson, B., Alvarez, B., Paul, S., Peters, B., & Nielsen, M. (2020). NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: Improved predictions of MHC antigen presentation. Nucleic Acids Research, 48(W1), W449–W454. doi

Richters, M. M., Xia, H., Campbell, K. M., Gillanders, W. E., Griffith, O. L., & Griffith, M. (2019). Best practices for bioinformatic characterization of neoantigens for clinical utility. Genome Medicine, 11, 56. doi

Robins, H. S., Campregher, P. V., Srivastava, S. K., Wacher, A., et al. (2009). Comprehensive assessment of T-cell receptor beta-chain diversity in αβ T cells. Blood, 114(19), 4099–4107. doi

Sahin, U., Derhovanessian, E., Miller, M., Kloke, B.-P., et al. (2017). Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature, 547, 222–226. doi

Schumacher, T. N., & Schreiber, R. D. (2015). Neoantigens in cancer immunotherapy. Science, 348(6230), 69–74. doi

Wells, D. K., van Buuren, M. M., Dang, K. K., Hubbard-Lucey, V. M., et al. (2020). Key parameters of tumor epitope immunogenicity revealed through a consortium approach improve neoantigen prediction. Cell, 183(3), 818–834.e13. doi

Yadav, M., Jhunjhunwala, S., Phung, Q. T., Lupardus, P., et al. (2014). Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature, 515, 572–576. doi

Walsh, I., Fishman, D., Garcia-Gasulla, D., Titma, T., Pollastri, G., ELIXIR Machine Learning Focus Group (2021). DOME: recommendations for supervised machine learning validation in biology. Nature Methods, 18, 1122–1127. doi

Attafi, O. A., Clementel, D., Kyritsis, K., et al. (2024). DOME Registry: implementing community-wide recommendations for reporting supervised machine learning in biology. GigaScience, 13, giae094. doi

NEOIMMUNE AI · İstanbul

Bilimsel koordinasyon, laboratuvar yürütmesi, biyoinformatik ve veri kabulü İstanbul'da tek merkezde toplanır. Platform geliştirme ve model teslimi aynı merkezin yazılım iş paketi tarafından yürütülür.

İstanbul, Türkiye · UTC+03:00

İki yetkilendirilmiş klinik merkez

Dermatoloji ve ilgili yetkili klinik birimler; her merkezin kendi etik kurul kararı, kurum izni ve veri/numune transfer ekiyle. Klinik kayıt üst hedefi 35 hasta, moleküler analiz kotası 32 hasta, değerlendirilebilir hedef ~24 hasta olarak ayrı ayrı izlenir.

Kimler başvurabilir

• Klinik merkezler ve patoloji birimleri
• Biyoinformatik ve AI araştırma grupları
• Dizileme, peptit sentezi ve TCR hizmet sağlayıcıları
• Fon kuruluşları ve düzenleyiciler